骨肉瘤(osteosarcoma,OS)屬于起源于間充質(zhì)的一種惡性骨腫瘤,是兒童與青少年罹患原發(fā)性惡性骨腫瘤疾病譜中最常見的。骨肉瘤患者的年齡分布呈現(xiàn)雙峰狀態(tài),分別為青春期人群與老年人群。青春期高峰集中在大約15歲。0~24歲組的骨肉瘤發(fā)病率為4.4/百萬。第二個峰值集中在75歲左右,主要由與佩吉特病或其他骨性病變相關(guān)的繼發(fā)性骨肉瘤組成。男性與女性的發(fā)病率之比為1.22:1。轉(zhuǎn)移仍然是骨肉瘤最重要的致命性并發(fā)癥,約有80%的骨肉瘤患者在確診時發(fā)現(xiàn)已存在轉(zhuǎn)移性或微小轉(zhuǎn)移性病灶。由于治療原則和化學(xué)療法的進(jìn)展,患者的5年生存率從不到30%提高到70%以上。

盡管有了上述進(jìn)展,但骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制研究仍任重而道遠(yuǎn),如何從根源上治愈骨肉瘤是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界面臨的難題之一。整合素連接激酶相關(guān)磷酸酶(integrin-linked kinase-associated phosphatase,ILKAP)是一種絲氨酸/蘇氨酸(S/T)磷酸化酶,與細(xì)胞的生存和凋亡有關(guān)。ILKAP同時也是一種具有調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展功能的抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物。ILKAP廣泛表達(dá)于人體組織中,主要在腎臟、骨骼肌、肝臟等臟器中表達(dá)水平較高。介導(dǎo)細(xì)胞凋亡是ILKAP的主要生理功能。

ILKAP與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是腫瘤微環(huán)境與腫瘤病因?qū)W研究中的重點(diǎn)。作為一種轉(zhuǎn)錄因子,HIF-1有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等一系列作用。HIF-1的含量一旦失調(diào),細(xì)胞將具備多種惡性能力并演變成腫瘤。早期研究認(rèn)為,細(xì)胞在正常微環(huán)境下,HIF-1主要受羥化酶的調(diào)節(jié)而進(jìn)入泛素降解途徑,而僅當(dāng)細(xì)胞處于低氧條件時HIF-1不能被降解,進(jìn)而發(fā)揮功能。近年來隨著對HIF-1調(diào)節(jié)方式的深入研究,人們發(fā)現(xiàn)羥化反應(yīng)并不是HIF-1轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)的途徑,磷酸化調(diào)節(jié)也是調(diào)控HIF-1的一種重要方式,尤其是在非低氧條件下。

研究目的:證實(shí)低氧可導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡；研究低氧條件下ILKAP通過與HIF-1α相互作用,對骨肉瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的相關(guān)影響。

研究方法:

1、細(xì)胞低氧模型的構(gòu)建與監(jiān)測:使用氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱將骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)從0h至96h將氣罐中充入了混合的O_2(1%)與N_2(94%)和CO_2(5%)。

調(diào)節(jié)氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱的溫度(37°C)、濕度(95%)。每24h更換細(xì)胞培養(yǎng)液。通過YSI模型55溶氧測定儀來監(jiān)測培養(yǎng)箱內(nèi)溶氧量,從而監(jiān)測低氧環(huán)境。

2、骨肉瘤細(xì)胞活力測定:臺盼藍(lán)染色試驗測定細(xì)胞存活率。將單細(xì)胞懸液與0.4%臺盼藍(lán)溶液以9:1混合混勻。每0.1 mL單細(xì)胞懸液中加入一滴臺盼藍(lán)染液,室溫下染色3~5 min,記錄活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)。將處理過的骨腫瘤細(xì)胞材料在高倍鏡下觀察。分別計數(shù)1000個細(xì)胞內(nèi)的活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù),統(tǒng)計未染色細(xì)胞,用公式計算細(xì)胞存活率。

3、骨肉瘤細(xì)胞凋亡檢測:本實(shí)驗采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)通過觀察骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)DAPI與TUNEL的共定位,判斷骨肉瘤細(xì)胞是否經(jīng)歷凋亡。

4、檢測HIF-1α、細(xì)胞凋亡標(biāo)記物:采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)—底物化學(xué)發(fā)光ECL法。

5、研究ILKAP在導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的作用:采用ILKAP shRNA腺病毒轉(zhuǎn)染與Ad-ILKAP過表達(dá)的研究方法。6、研究HIF-1α、ILKAP、p53之間的相互作用:對細(xì)胞進(jìn)行了72h低氧處理,而后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗。研究結(jié)果:1、細(xì)胞活力隨著時間延長而下降,細(xì)胞凋亡增加(P<0.05)。HIF-1α隨低氧處理時間延長逐步被誘導(dǎo),磷酸化HIF-1α逐漸減少。通過400U ILKAP處理HIF-1α,PBS作為陰性對照,400Uλ磷酸酶作為陽性對照,發(fā)現(xiàn)ILKAP和λ磷酸酶對于HIF-1α的作用相似,可使去磷酸化HIF-1α逐漸增多。2、低氧條件下細(xì)胞存活由ILKAP shRNA維持。低氧條件下細(xì)胞凋亡與ILKAP有關(guān)。

相同低氧時間下,ILKAP shRNA組的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯少于對照組(P<0.05)。Western blot條帶顯示HIF-1α在ILKAP shRNA組與對照組比較,大部分沒有轉(zhuǎn)為去磷酸化形式。3、通過免疫共沉淀實(shí)驗發(fā)現(xiàn),磷酸化形式的HIF-1α優(yōu)先與抗ILKAP抗體免疫沉淀,去磷酸化形式的HIF-1α優(yōu)先與p53抗體免疫共沉淀,ILKAP與p53之間沒有相互作用。4、相比于對照組,Ad-ILKAP組的細(xì)胞存活率顯著減少,呈時間依賴性(P<0.05)。細(xì)胞凋亡標(biāo)記物和TUNEL法在Ad-ILKAP組相比于對照組,反映出顯著增加的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。常氧條件無法誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá),但在Ad-ILKAP組可檢測。

結(jié)論:1、細(xì)胞凋亡數(shù)量會隨著低氧處理時間延長而顯著增加。ILKAP可以起到類似于λ磷酸酶的去磷酸化作用。HIF-1α磷酸化狀態(tài)在持續(xù)的低氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)生改變,ILKAP可使HIF-1α從磷酸化狀態(tài)轉(zhuǎn)為去磷酸化狀態(tài)。2、長時間低氧誘導(dǎo)情況下,下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ILKAP表達(dá),則細(xì)胞凋亡減少。由此可見,ILKAP在長時間低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。3、ILKAP結(jié)合磷酸化形式的HIF-1α使其去磷酸化,然后與去磷酸化形式的HIF-1α分離,去磷酸化的HIF-1α則與p53結(jié)合。ILKAP不與p53直接作用。4、常氧無法誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)。在常氧情況下,上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ILKAP表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且使HIF-1α去磷酸化。綜上所述,ILKAP直接使HIF-1α去磷酸化,并且對后續(xù)p53依賴的細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用。考慮到其與p53及p53本身的復(fù)雜作用,我們現(xiàn)階段的實(shí)驗結(jié)果為進(jìn)一步研究不同HIF-1α類型在多種疾病中的作用基因奠定了基礎(chǔ)。